-----无限传代不是梦，细胞实验从此告别稀缺困扰

       在体外细胞实验中，稳定且足量的细胞资源是各类研究的重要基础。然而，常规细胞在传代过程中会逐渐衰老，最终失去分裂能力，这一现象被称为 "Hayflick极限"。

一、什么是永生化细胞？它与癌变有什么区别？先搞懂“Hayflick极限”

       要理解永生化细胞，得先从一个经典发现说起——1961年，科学家Leonard Hayflick提出“Hayflick极限”：正常体细胞在体外培养时，分裂次数存在上限（通常50-60次），之后会进入衰老期，失去增殖能力并最终凋亡。这就像细胞自带的“寿命倒计时”，限制了体外研究的深度。

       永生化细胞，就是通过自发突变或人为干预，突破这个“寿命枷锁”，获得无限增殖能力的细胞。关键是，它们大多能保留原代细胞的核心生物学特性，且在无额外致癌突变的情况下，一般不会自发癌变，是科研中理想的“标准化工具”。而癌变是一个多步骤的恶性转化过程，不仅包括永生化，还包括失去接触抑制、获得侵袭转移能力、诱导血管生成、逃避凋亡等。永生化是癌变的必要条件之一，但不是充分条件。 绝大多数永生化细胞在植入免疫缺陷小鼠后不会形成肿瘤。

核心原理：两大“续命密码”基因

      细胞之所以会衰老，核心是两大机制在“作祟”：端粒缩短和抑癌基因调控。而永生化技术，本质就是通过干预这两大机制实现“续命”，其中最常用的是两种关键基因：

SV40大T抗原（TAg）：就像“抑癌基因抑制剂”。它能与细胞内的抑癌蛋白p53结合形成复合体，让p53失去活性，从而阻断细胞衰老和凋亡信号，促使细胞持续增殖。

人端粒酶逆转录酶（hTERT）：堪称“端粒守护者”。端粒是染色体末端的“保护帽”，每次细胞分裂都会缩短一截，短到临界值就会启动衰老程序。而hTERT是端粒酶的核心催化亚基，能合成端粒DNA并延长端粒，维持染色体稳定，从根源上阻止衰老。这一机制的发现，让hTERT成为目前应用最广泛的永生化工具基因。

二、手把手教你建永生化细胞：5步流程+关键细节

       目前最成熟的永生化方法是“慢病毒介导的目的基因导入法”，整个流程可分为“细胞准备-病毒包装-感染细胞-筛选纯化-鉴定验证”5个核心步骤，每一步都有关键控制点，缺一不可。

1. 细胞系选择和状态确认

选择慢病毒包装细胞（如人胚肾细胞；HEK-293T-如耀生物）和目标细胞（如永生化人膀胱上皮细胞；SV-HUC-1(STR)-如耀生物、永生化人肥大细胞；LUVA-如耀生物），均应处于对数生长期且状态良好

2. 慢病毒包装：质粒质量是关键

将含目的基因（hTERT或SV40大T抗原）的转移质粒、包装质粒和包膜质粒，通过脂质体或电转法共转染到HEK-293T细胞中。这里有个黄金标准：质粒浓度需在400-1000 ng/μL，纯度A260/280在1.8-2.0之间，否则会严重影响转染效率。转染48-72小时后，收集上清液，离心纯化得到重组慢病毒颗粒。

3. 病毒感染：MOI值优化是核心

将靶细胞接种到24孔板（浓度1×10⁵/mL），37℃，5% CO2过夜培养后更换新鲜培养基，慢病毒置于冰上解冻，加入慢病毒（**MOI值）和聚凝胺（终浓度8 μg/mL，增强病毒吸附）37℃，5% CO2培养48 h。

u 最关键的是优化MOI值（病毒颗粒数与细胞数的比值）——不同细胞MOI差异大，比如上皮细胞MOI通常为10-20，而难感染的树突状细胞需50以上，建议通过预实验筛选**值，兼顾感染效率和细胞毒性。

4. 抗性筛选：最低致死浓度是标尺

慢病毒载体通常携带抗性基因（如嘌呤霉素抗性），感染48h后，用含嘌呤霉素的培养基筛选。先做浓度梯度预实验，找到“3天内杀死所有未感染细胞”的最低浓度，用这个浓度持续筛选7-10天，直到存活的细胞形成单克隆。

5. 鉴定验证：三重验证保可靠

①基因层面：qPCR检测hTERT或SV40大T抗原的表达，确保目的基因稳定整合

②功能层面：β-半乳糖苷酶染色（衰老细胞呈蓝色，永生化细胞染色阴性），并连续传代，验证增殖稳定性

③表型层面：免疫荧光检测细胞特异性标志物，确认原代特性保留

细胞永生化技术步骤（图片来自网络）

！注意：永生化细胞长期传代后可能发生基因漂变，导致实验结果偏差，因此需定期进行STR鉴定等质控

如耀生物STR鉴定报告

三、避坑指南：这些注意事项能省你30%实验时间

l质粒纯度与浓度

用于转染的质粒必须为高纯度、无内毒素。

浓度： 400 - 1,000 ng/μL，以确保转染时加入的质粒体积适中，不影响复合物形成。

纯度： A260/A280 比值应在 1.8 - 2.0 之间，A260/A230 比值应 > 2.0。后者过低表明有盐、胍或酚类残留，会严重干扰转染效率。

l转染试剂与DNA的比例

转染试剂（如PEI）与质粒DNA的质量比通常在 1:1 到 3:1 之间（如，1 μg DNA : 3 μL PEI）。此比例需通过预实验确定**值。

l病毒操作：避免反复冻融，长期储存需测滴度

慢病毒颗粒很“娇贵”，反复冻融会让滴度下降50%以上，建议分装成单次用量冻存（-80℃可存6个月）。超过6个月使用前，必须用CCK-8法重新测滴度，否则可能因病毒活性不足导致感染失败。

l难感染细胞：试试“二次感染法”

像树突状细胞DC、神经干细胞NSCs这类难感染细胞，单次感染效率常低于30%。可采用“二次感染法”：首次感染24h后，更换新鲜病毒液再感染一次，能将效率提升至60%以上。

-----------------------------------------------------------------------------------------------------------如耀生物-----------------------------------------------------------------------------------------

【核酸平台】基因扩增，核酸提取，分子克隆，亚克隆，点突变，shRNA，siRNA，miRNA，LncRNA，snRNA，微小核酸，ctDNA，焦磷酸测序，甲基化，SNP分析

【蛋白平台】免疫印迹，免疫荧光，coIP，chip，emsa，2D电泳，ELISA，抗体标记，抗体质量评估，抗原抗体作用力分析

【细胞平台】原代细胞培养，建系；肿瘤细胞，细胞增殖，细胞周期，细胞凋亡，细胞迁移，细胞侵袭，细胞药敏，小分子靶向药物，天然药物，植物药单体，流式细胞平台（免疫细胞分型，细胞绝对计数，细胞凋亡分析，细胞周期分析，细胞磷酸化分析，细胞因子多重检测）

【慢病毒技术】沉默基因技术，过表达技术，crispr技术，基因编辑技术，病毒大规模扩增，病毒浓缩，病毒滴度检测，病毒感染效率分析，靶向基因沉默技术

【病理平台】HE，免疫组化，组织免疫荧光，FISH（原位免疫荧光杂交），PAS染色，纤维染色，神经元染色，双染

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